La Theotòkos c'est une typique icône byzantine peinte sur bois doré. La Vierge aux grands yeux, soutient l'Enfant qui bénit, selon le type iconographique dit "Odigitria" ("celle qui enseigne la route"). L'auteur en est inconnu. Probablement c'est une des nombreuses icônes que les moines grecs de l'Italie méridionale reproduisirent en imitant celles que la fureur des Iconoclastes avait détruites en Orient.
En 1140, Ptolémé II, comte de Tusculum, vola à l'église des objets précieux, et parmi ceux-ci peut-être y eut-il l'icône de la Vierge. Le fait est qu'une tradition bien établie dit que cette icône fut vénérée pendant de nombreuses années dans une église de Tusculum. En 1191 Tusculum fut détruit par les Romains et l'icône portée à Rome. En 1230 elle fut rendue aux moines de l'abbaye par le pape Grégoire IX et solennellement intronisée.
Pendant une longue période, elle fut placée dans le Nartex, protégée par deux battants de bois ornés des images des Saints Fondateurs St. Nil et St. Barthélémy. Au déut du XVIIe siècle on la plaça au centre de "l'ensemble" baroque conçu par Bernin. En 1687 le Vénérable Chapitre du Vatican en décrétait le couronnement.
Cette icône a été source de nombreuses grâces divines et a toujours attiré à elle des foules de fidèles et de pèlerins parmi lesquels de nombreuses figures de saints et de papes. Parmi ceux-ci Pie IX, qui venait souvent prier devant son autel; Jean XXIII, qui vint en 1960 et Paul VI qui, le 19 août 1963, adressa de là un appel aux frères séparés d'Orient. Le Pape Jean Paul II est venu visiter le Monastère une première fois en 1979, puis le 7 septembre 1987, à l'occasion de l'inauguration de l'année Mariale, et y a présidé les vêpres solennelles byzantines célébrées par la communauté monastique.
L'afflux des pèlerins aux jours de fête de la Mère de Dieu fut si grand dès les origines, qu'on devait dresser des tentes et installer des éventaires de victuailles pour pourvoir aux nécessités des foules. Ainsi naquirent, depuis le Moyen-Age, les deux foires de Grottaferrata, une le 25 mars, fête de l'Annonciation, l'autre, le 8 septembre, fête de la Nativité de Marie. Celle de l'Annonciation a été déclarée depuis 1966 foire nationale des machines agricoles.